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日前，來自麻省總醫(yī)院的研究人員發(fā)現(xiàn)，對被稱作 CRISPR-Cas RNA 指導(dǎo)的核酸酶（CRISPR-Cas RNA -guided nucleases, RGNs）的人工合成酶中的向?qū)?RNA （guide RNA , gRNA ）組分的長度進(jìn)行調(diào)整能夠顯著性地降低在非靶位點(diǎn)上的 DNA 突變發(fā)生率。

    論文主要作者 Keith Joung 博士表示：“只需縮短 gRNA 靶向區(qū)域的長度，在我們研究過的之前已知的所有脫靶位點(diǎn)（off-target site）上觀察到不想要的突變頻率下降。相比于全長的 gRNA ,一些位點(diǎn)的突變頻率下降了 5000 倍乃至更多，而且重要的是，這些截斷的 gRNA ---我們稱之為 tru-gRNA ---與全長 gRNA 一樣高效地找到事先確定的靶 DNA 片段。”

    CRISPR-Cas RGNs是將一種被稱作 Cas9 的基因剪切酶和一段短的 RNA 片段結(jié)合在一起而形成的，能夠被用來誘導(dǎo)與該 RNA 片段互補(bǔ)的 DNA 片段產(chǎn)生斷裂以便引入基因變化。2013 年，Joung 研究小組就已報道，在人細(xì)胞中，CRISPR-Cas RGNs 也能夠?qū)е屡c靶位點(diǎn)相差高達(dá) 5 個核苷酸的 DNA 序列發(fā)生突變，這就限制了它們的臨床應(yīng)用。該研究小組隨后進(jìn)行追蹤研究以便驗證一種看似違反直覺的假設(shè)：縮短 gRNA 片段可能會降低脫靶突變。

    Joung 解釋道：“我們?nèi)ツ甑囊恍?shí)驗提示著人們能夠讓 gRNA 互補(bǔ)區(qū)的一端錯配幾個核苷酸而不影響它的靶向活性。這就讓我們想要了解一下移除這些核苷酸是否能夠讓這種系統(tǒng)對剩余序列中的錯配更加敏感。”

    基于細(xì)菌物種用來抵抗其他致病原的一種天然系統(tǒng)，這種已被廣泛使用的 CRISPR-Cas RGNs 包括 gRNA 中的一個長 20 個核苷酸的靶向區(qū)域。為了驗證這種假設(shè)，研究人員構(gòu)建逐漸縮短的 RGNs,結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管具有長 17 或 18 個核苷酸的靶向片段的 gRNA 與全長 gRNA 一樣或者比全長 gRNA 更加高效地到達(dá)它們的靶位點(diǎn)，但是具有長 15 或 16 個核苷酸的靶向片段的 gRNA 靶向活性下降或者丟失。隨后的實(shí)驗發(fā)現(xiàn)靶向片段長 17 個核苷酸的截斷 RGNs 在人細(xì)胞中高效地誘導(dǎo)所需的突變，同時極大地降低脫靶效應(yīng)或不能檢測到脫靶效應(yīng)，即便是在只存在一兩個核苷酸錯配的位點(diǎn)，也是如此。

    Joung 表示：“盡管我們并沒有充分地理解 tru-gRNA 降低脫靶效應(yīng)的機(jī)制，但是我們的假設(shè)是這種原先[未截斷]的系統(tǒng)可能具有比它所需更多的能量，從而能夠讓它切割甚至不完全匹配的位點(diǎn)。通過縮短 gRNA ,我們可能將這種能量降低到剛好足以實(shí)現(xiàn)靶向活性的水平，從而讓這種核酸酶更不可能切割脫靶位點(diǎn)。但是，還需更多的研究來精確地確定 tru-gRNA 為何能夠降低脫靶效應(yīng)。”